CULTURE ET CARYOTYPE

La technique de culture décrite utilise un milieu défini destiné à faire pousser tous types de cellules adhérentes et particulièrement les cellules tumorales difficiles à cultiver dans les conditions normales et à réduire le développement des fibroblastes.

TEYSSIER J.R. Nonrandom chromosomal changes in human solid tumors:application of an improved culture method.
J Natl Cancer Inst 1987 Dec;79(6):1189-98.

Des fragments tumoraux de 0,5 à 1 cm3 sont prélevés le plus stérilement possible et acheminés au laboratoire dans les plus brefs délais dans un flacon contenant 5 ml de milieu de transport: Ham/DMEM + 20% SVF.

1) Dissociation mécanique:
Eliminer les plages hémorragiques ou nécrotiques et dissocier le fragment tumoral à l'aide de scalpels le plus finement possible.

2) Dissociation enzymatique:
Reprendre les fragments découpés dans env. 15 ml du mélange collagénase/Dnase et incuber à 37° en agitant de temps en temps.

Dès que la suspension devient homogène (en général, au bout de 2 heures),faire un lavage en milieu de culture et centrifuger à 1000 tours pendant 10 mn.
Après cette étape, le surnageant est éliminé et le culot cellulaire est prêt à être ensemencé.

Le culot cellulaire est repris dans du milieu de culture constitué de Ham F12/DMEM + 2% du mélange PS + 0,2% de la sol. de fungizone + supplément T5 (voir ci-dessous) + ou - SVF(10% maxi.)

Le tout est ajusté en volume de manière à ensemencer env. 500 000 cellules vivantes/ml. (Lecture sur cellule de Thoma et coloration vitale avec Nigrosine-Eosine).

La suspension est ensemencée en boîtes plastiques type Falcon de 25 cm2 à raison de 8 ml/boîte.
Si la quantité de cellules est suffisante, on ensemencera 3 boîtes de culture renfermant respectivement 0% 2% et 10% de SVF; sinon on supplémentera avec au moins 2% de SVF.

Le tout est placé en étuve 3 gaz: 5% CO2, 5%O2, 90%N2. à 37°C.

1) Evolution de la culture:

A J1, changer le milieu de culture si ce dernier est trop jaune. (Le jaunissement est en général du à une grande quantité de cellules nécrosées plus qu'à une croissance cellulaire très active.)

Observer au microscope inversé pour apprécier la quantité de cellules fixées et l'apparition éventuelle de foyers.

A J2 et jours suivants, l'évolution de la culture est contrôlée; le milieu de culture est changé tous les 2 jours.

Si la culture ne renferme pas de fibroblastes, on pourra changer avec du milieu renfermant 10% de SVF. Dans le cas contraire, on changera en 0% SVF pour stopper la croissance de ces derniers.

Dès qu'un nombre suffisant de foyers est présent, la culture est amplifiée.

2) Amplification de la culture:

Rincer la boîte avec 3 à 4 ml de PBS. Vider.
Ajouter 3 à 4 ml de trypsine-EDTA [X1].
Laisser agir env. 30 sec.
Vider.
Mettre la boîte à 37° quelques minutes.
"Tapoter" la boîte pour activer le décollement, puis ajouter 8 ml de milieu de culture.
Selon la richesse cellulaire, il est possible de ré-ensemencer plusieurs boîtes.

A l'issue de cette amplification, les flasks sont destinés à la réalisation du caryotype.
Le lendemain de la trypsination, changer le milieu. Dès que la culture atteint 70 à 80% de confluence, elle est stoppée et le traitement pour l'obtention du caryotype est réalisé.

E) TRAITEMENT:

Ajouter 200µl de colchicine à 4µ/ml par boîte.
Laisser à 37°C pendant 2 h.

2) Recueil des cellules:

Trypsiner la flask comme indiqué précédemment en ayant soin de recueillir le milieu de culture dans un tube à centrifuger type Lejeune avant trypsination.
Recueillir les cellules après trypsination dans le milieu de culture conservé.
Rincer avec quelques ml de PBS.
Centrifuger pendant 10 mn à 1000 tours/mn.

3) Choc hypotonique:

Composition de la solution hypotonique:

Mélange volume à volume des 2 solutions suivantes:

-1 vol S.V.N.N et 5 vol d'eau distillée.
- KCl 0,075M en eau distillée.

Eliminer le surnageant à l'aide de la trompe à vide en s'arrêtant à environ 0,5cm du culot.
Vortexer pour remettre le culot en suspension.
Remplir le tube avec la solution hypotonique.
Agiter.
Laisser à l'étuve pendant 5 mn à 37°C.(ce temps peut être variable au cours de l'année)

4) Préfixation:

Préfixer en ajoutant qqs gouttes de fixateur (1 vol acide acétique / 3 vol éthanol absolu) sur la solution de choc.
Centrifuger 10 mn à 1000 tours/mn.

5) Fixation 1:

Eliminer le surnageant.
Remettre le culot en suspension en vortexant doucement.
Remplir le tube de fixateur.
Agiter.
Laisser une heure à température ambiante.
Centrifuger à 1000 tours/mn pendant 10 mn.

6) Fixation 2:

Répéter les mêmes opérations que pour la fixation 1.
Laisser 1 h à température ambiante ou mettre à 4°C si l'étalement est réalisé le lendemain.

7) Etalement:

A l'issue des 2 fixations, centrifuger à 1000 tours/mn pendant 10 mn.
Eliminer le surnageant comme deans les étapes précédentes.
Vortexer.
Apprécier la richesse du culot; ajouter quelques gouttes de fixateur si la suspension paraît trop concentrée.
A l'aide d'une pipette Pasteur déposer 3 à 4 gouttes de suspension homogène sur de lames dégraissées, rincées et placées préalablement à 4°C dans de l'eau distillée.
Laisser sécher les lames à plat une nuit avant l'étape de dénaturation.

F) DENATURATION: (bandes R)

Préchauffer à 87°C des bacs en porcelaine contenant une solution de Hanks dont le pH est contrôlé chaque jour et ajusté au voisinage de 7,20 (variable selon les périodes de l'année).
Réhydrater les lames en eau distillée pendant 15 mn.
Plonger les lames dans la solution de Hanks.
Le temps de dénaturation est également variable et à déterminer pour une dénaturation optimale:en général, entre 45 mn et 1h10mn.
Effectuer 2 séries de dénaturation sur des lames différentes de manière à pouvoir éventuellement réajuster le temps de trempage après contrôle des lames issues de la première série.

Préparation du colorant:
Giemsa: 2 ml
Na2HPO4 0,2M: 2 ml
Eau distillée QSP 100 ml

Au terme de la dénaturation, retirer les lames et les placer dans un bac à coloration.
Les rincer abondament à l'eau du robinet.
Colorer au Giemsa pendant environ 3 mn et rincer à l'eau du robinet.

H) PRISE DE VUES:

Sur photomicroscope ou analyseur d'images.

REACTIFS

Milieu de culture :

DMEM/NUT. MIX.F-12 ( avec glutamax-I, avec pyridoxine)
GIBCO BRL - Réf : 31331-028. Conservation à 4°C.

Suppléments au milieu de culture :

Fetal Calf Serum SVF:
Boehringer Mannheim - Réf : P46162
Flacons de 500 ml reçus congelés, conservés à -20°C

Antibiotiques:
Mélange Pénicilline-Streptomycine (PS) (200000UI de pénicilline, 50 mg de streptomycine)
GIBCO BRL - Réf : 15145-014
Flacons lyophyllisés QSP 20 ml eau distillée, conservés à 4°C

Antifongique:
Fungizone (=Amphotéricine B)
Pharmacie CHR.
Flacons de 50 mg à diluer dans 100 ml eau distillée, conservés à -20°C.

Supplément en facteurs détoxifiants, hormonaux et de croissance (nommé T5) :
Fabriqué au laboratoire, concentré 50 fois.
Ce supplément convient à la culture de tous les types cellulaires et favorise le développement de tumeurs difficiles à cultiver.Il permet également de réduire le % de SVF contenu dans le milieu de culture , voire même de cultiver sans sérum.

        Composition et protocole de fabrication pour 200 ml de supplément [x50] :

Préparer au préalable 300 ml de PBS amené à pH 10 avec NaOH 10N.

Hydrocortisone:(H 0888 Sigma). Conc. finale dans milieu de culture: 4ng/ml.
Peser 8 mg, dissoudre dans 1 ml d'éthanol absolu; diluer au 1/100 en Ham/DMEM
Prendre 0,5 ml.

Insuline: (I 1882 Sigma) . Conc.finale dans milieu de culture: 10µg/ml.
Peser 100 mg à diluer dans env. 20 ml de PBS pH 10 .(Si la dilution n'est pas complète, ajouter quelques µl de NaOH.)

Glucagon: (Pharmacie CHR flacon de 1 mg lyophylisés). Conc. finale dans milieu de culture:0,2µg/ ml.
Diluer 2 flacons dans 1 ml d'eau distillée.

Tri-iodo-thyronine: (T6397 Sigma). Conc. finale dans milieu de culture: 0,6ng/ml.
Peser 12 mg, diluer dans 200 ml de PBS pH 10.(Si la dilution n'est pas complète,ajouter quelques µl de NaOH 10N).
Prendre 100 µl.

Transferrine: (GIBCO ref 13008 - 016). Conc. finale dans milieu de culture: 10µg/ml.
Diluer un flacon de 100 mg lyophylisé dans 10 ml de Ham/DMEM.

Sodium sélénite: (S5261 Sigma) . Conc. finale dans milieu de culture: 4ng/ml.
Peser 10 mg à diluer dans 25 ml de HAM/DMEM.
Prendre 100µl.

Catalase: (C40 Sigma). Conc. finale dans milieu de culture: 50 U/ml.
Peser 280 mg et diluer dans env. 20 ml de Ham/DMEM.
Il est recommandé de filtrer la solution de catalase sur Millex avant de l'incorporer aux autres composés car elle est souvent impure et sa dilution n'est jamais totale.

Non Essential Amino Acides: (GIBCO ref. 11140-035). Conc. finale dans milieu de culture: 10 µl/ml.
Prendre 1 ml de la solution mère [X100].

Acide linoléique Sérum albumine : (L8384 Sigma). Conc. finale dans milieu de culture:100 µg/ml.
Diluer 2 flacons de 500 mg en Ham/DMEM.

Vitamine C : (A4403 Sigma). Conc. finale dans milieu de culture: 50µg/ml.
Peser 500 mg.
Diluer dans env. 20 ml de Ham/DMEM et ajouter NaOH [10N] jusqu'au virage au violet de l'indicateur coloré contenu dans le milieu.

EGF( Epithélial Growth Factor) (GIBCO BRL. ref.53003-018). Conc. finale dans milieu de culture: 4ng/ml.
Flacons de 100 µg lyophilisés.
Diluer un flacon avec 3 ml d'eau distillée .
Prendre 1,2 ml.
Le surplus peut être recongelé à -80°C.

Mélanger ensuite toutes les solutions ainsi préparées et ajuster à un volume de 200 ml avec du Ham/DMEM. Filtrer sur membrane Millipore 0,22µ.Aliquoter en cryotubes sous 4ml et conserver à -80°C.

ATTENTION: Il est impératif que toutes les solutions soient préparées en milieu alcalin afin d'éviter la précipitation de certaines protéines lors du mélange en particulier de l'insuline et de la tri-iodo-thyronine.

Le rouge de phénol contenu dans le milieu HAM/DMEM suffit à l'appréciation du pH . (8-8,5).

Autres réactifs :

Mélange collagénase - DNase:
Collagénase type II: Sigma ref. C6885 Flacon de 1 g.
Désoxyribonucléase I: Sigma ref. D 25 Flacon de 100mg.
Dissoudre dans 700 ml de milieu Ham/DMEM 1 flacon de collagénase de 1g et 2 flacons de DNase de 100 mg.
Ajouter 70 ml de SVF.
Filtrer sur membrane Millipore de 0,22µ.
Aliquoter en flacons de 100 ml et conserver à -20°C.

Tampon PBS:
Biomérieux ref. 89641.
Flacons lyophylisés QSP 1l de tampon conservés à température ambiante.

Trypsine - EDTA:
Sigma ref.T4174. Flacons de 100 ml : solution [x10]
Flacons reçus congelés, conservés à -20°C.
A diluer au 1/10 en PBS au moment de l'emploi.

Hanks: HBSS [x10]
GIBCO BRL ref. 14065-049. Conservation à température ambiante.
A diluer au 1/10 en eau distillée au moment de l'emploi.

Na2HPO4 0,2M:
MERCK ref. 6574. poudre.
Peser 7,058g de poudre QSP 250 ml eau distillée.

Giemsa R:
RAL ref. 320313
Flacons de 1l conservés à température ambiante.

Acide acétique glacial:
MERCK ref K 24994463
Flacons de 1l conservés à température ambiante.

Ethanol absolu Normapur:
PROLABO ref. 208216 - 365
Flacons de 5 l conservés à température ambiante.

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