LA TECHNIQUE

SYNCHRONISATION
SUR LIQUIDES AMNIOTIQUES

D. FERRE , L. LAFON, N. TA PHI THANH

Tel: 03 26 78 85 89

Laboratoire de biologie prénatale

CHU  REIMS

Cette technique est tirée de celle utilisée pour la synchronisation des lymphocytes. Mise à part la technique de culture propre aux cellules en monocouche, elle s'en distingue essentiellement par la concentration de la Thymidine (3 fois plus concentrée) et le temps entre le lavage+ incorporation de Budr et la récolte (8 h. au lieu de 6h.)

PREPARATION DES CULTURES

·        Amplifier la culture par trypsination et faire

     3 ou 4 boîtes de richesse différente. Laisser en culture pendant 24 h.

     en Ham/DMEM + 20% SVF (ou UG).

·        Synchroniser à partir de 60 – 70% de confluence env. Les boîtes les plus pauvres seront synchronisées le lendemain et les plus riches trypsinées à nouveau pour une synchronisation ultérieure, si besoin.

INCORPORATION DES REACTIFS

·        16h : Incorporation de la Thymidine à la concentration finale de 1mg/ml de milieu.

• Culture remise à l’étuve jusqu’au lendemain.
• 8h : 2 lavages en milieu préchauffé à 37°C puis incorporation de BUDR à la concentration finale de 10µg/ml de milieu
• 15h-15h30 : Ajout de la colchicine: 0,2 ml colchicine à 4µg/ml
• 16h : Arrêt de la culture et récolte des cellules.

OBTENTION DES PROMETAPHASES

• Décollement des cellules à l’aide de trypsine-EDTA 
• Choc hypotonique dans la boîte: 7 mn à 37°C (temps à adapter au labo…)

Composition du choc: Mélange vol/vol de:                                                                    

-         sérum de veau nouveau né + eau distillée (1vol/5vol) 

-         KCl 0,075M.

·        Préfixation  acide acétique/éthanol (1vol/3vol) : quelques gouttes et transvasement de la suspension dans un tube à centrifuger

·        Centrifuger 10mn à 1000tr/mn

·        Fixation 1: acide acétique/éthanol (1vol/3vol) pendant une nuit

• Centrifuger  10mn à 1000tr/mn
• Fixation 2 : le lendemain; même fixateur pendant au moins 1 heure.
• Fixation 3 éventuelle  (même fixateur).
• Etalement sur lames super Frost plongées préalablement dans l’eau distillée à 4°C et laissées sur la paillasse jusqu’au lendemain.

 COLORATION DES LAMES

• •Préparation d’une solution de Hoescht 33258 (bis BENZIMIDE) au 1/200 en PBS   à partir d’une solution mère   à 0,1mg/ml en PBS conservée à 4°C.
• Placer les lames à plat dans un bac réfléchissant bien la lumière (bac blanc en mélamine) contenant la solution fille de Hoescht et les irradier sous UV pendant 1 heure.
• Dénaturation brève des lames (env. 20 mn) en tampon HBSS pH 5-5,05 à 87°.
• Coloration en Giemsa à 3% tamponné avec Na2HPO4  0,2M 0,2 M pendant 3 à 4 mn.

REFERENCE DES PRINCIPAUX REACTIFS:

·        Milieu de culture: DMEM/F12 +glutamax  GIBCO  ref: 31331

·        Colchicine: KaryoMAX Colcemid 10µg/ml  GIBCO ref: 15212-046

·        Thymidine: SIGMA  1g  ref: T 1895

·        Budr: 5 bromo 2^,deoxyuridine  1g   SIGMA  ref: B 9285

·        Hoescht: bis Benzimide  500mg   SIGMA  ref: B 2883

Les dilutions de thymidine et budr sont aliquotées en cryotubes et conservées à –20°C